Введение

В последнее время характеристикам мягких тканей вокруг дентальных имплантатов уделяется значительное внимание. Известно, что такой параметр, как ширина кератинизированной прикрепленной слизистой оболочки, является важным фактором для поддержания здорового состояния тканей пародонта и тканей, окружающих дентальные имплантаты [Ашурко и др., 2022; Cairo et al., 2019; Lee et al., 2021]. Большой интерес в области хирургической стоматологии в настоящее время уделяется изучению другого параметра периимплантного фенотипа – толщине мягких тканей вокруг имплантатов [Puisys et al., 2019; Cosyn et al., 2021]. Толщина мягких тканей имеет важное значение для достижения удовлетворительного эстетического результата, который определяется цветом, текстурой и контуром мягких тканей, что особенно актуально при проведении имплантации во фронтальном отделе верхней челюсти [Testori et al., 2018; Zuiderveld et al., 2018]. Принято считать, что минимально допустимой является толщина мягких тканей в 2–3 мм, и в случае ее дефицита необходимо проводить реконструктивные операции [Тарасенко, Загорский, 2019; Avila-Ortiz et al., 2020].

Таким образом, увеличение толщины мягких тканей является важным этапом при проведении дентальной имплантации, который может быть выполнен как с применением аутогенных тканей, так и с использованием их заменителей [Rojo et al., 2018; Ashurko et al., 2022a]. Использование заменителей мягких тканей представляется все более привлекательным для практического применения. Недавние исследования сообщают об успешном использовании ксеногенных коллагеновых матриксов, которые сокращают время операции, снижают частоту осложнений, болезненность манипуляции и демонстрируют хороший эстетический результат [Ашурко и др., 2022; Gargallo-Albiol et al., 2019; Angelis De et al., 2021].

Большинство авторов сходятся во мнении, что именно ксеногенные коллагеновые матрицы являются достойной заменой аутогенным трансплантатам за счет их способности к полной биодеградации, быстрой васкуляризации, замещению соединительной тканью и биосовместимости [Puisys et al., 2019; Toledano et al., 2020b]. При этом необходимо отметить недостаточное количество исследований, посвященных изучению особенностей гистологического строения и морфометрических характеристик мягких тканей, полученных с применением коллагеновых матриксов с поперечно-сшитой структурой, в особенности при их использовании во фронтальном отделе верхней челюсти.

Объекты и методы исследования

Данное рандомизированное контролируемое продольное исследование с двумя параллельными группами проводилось на клинической базе кафедры хирургической стоматологии Института стоматологии им. Е.В. Боровского Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, в рамках которого было обследовано и прооперировано 30 пациентов с диагнозом «частичное отсутствие зубов», у которых был выявлен дефицит толщины мягких тканей в зоне планируемой установки имплантатов. Все пациенты методом случайной выборки были распределены на 2 группы. Для увеличения толщины мягких тканей в области установленных дентальных имплантатов у пациентов 1-й группы (N = 15) проводилась пересадка свободного соединительнотканного трансплантата (ССТ) из области бугра верхней челюсти, во 2-й группе (n = 15) использовался коллагеновый матрикс (КМ) Fibro-Gide (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland).

В исследование были включены 16 женщин и 14 мужчин в возрасте от 18 до 45 лет. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено этическим комитетом Первого МГМУ им. И.М. Сеченова. Данное исследование было также зарегистрировано в международном реестре клинических исследований ClinicalTrials.gov (№ NCT05551962).

Операцию выполняли стандартным образом: проводили разрез по вершине альвеолярного гребня в пределах дефекта, откидывали полнослойный слизисто-надкостничный лоскут, по стандартному протоколу устанавливали дентальный имплантат. Далее у пациентов 1-й группы проводили забор свободного соединительнотканного трансплантата с неба или бугра верхней челюсти и фиксировали трансплантат при помощи горизонтального П-образного шва к вестибулярному слизисто-надкостничному лоскуту. У пациентов 2-й группы аналогичным образом фиксировали фрагмент коллагенового матрикса. Следующим этапом операции у пациентов обеих групп была мобилизация слизисто-надкостничного лоскута с последующим наложением простых узловых швов без натяжения. В постоперационном периоде пациентам назначали стандартную антибактериальную и противовоспалительную терапию с применением местных антисептиков для ежедневного ухода в первые 5–7 дней.

Через 3 месяца после оперативного вмешательства на этапе установки формирователей десны в области ранее проведенного увеличения толщины слизистой оболочки при помощи мукотома провели забор фрагмента мягких тканей с обнажением винта-заглушки имплантата.

Биоптаты фиксировали в забуференном формалине, обезвоживали в изопропаноле, заливали в парафин, получали срезы толщиной 4 микрона, окрашивали гематоксилином-эозином, пикросириусом красным, орсеином. Окрашенные срезы заключали в синтетическую среду «Shandon mount» (США). Изучали при светлопольной, фазово-контрастной и поляризационной световых микроскопиях в микроскопе Leica DM 4000 B LED с камерой Leica DFC 7000 T. В лицензионной программе ImageJ на изображениях микропрепаратов при увеличении ×50 через каждые 100 мкм измеряли толщину слоев в биоптатах десны пациентов: эпителиальный слой (отдельно длина и количество гребней), сосочковый (отдельно длина сосочков) и сетчатый слои. Также на 100 мкм² слизистой оболочки десны были подсчитаны площадь сосудов, плотность расположения коллагеновых и эластических волокон, количество клеток воспаления.

Статистический анализ экспериментальных данных проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7.00. Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного анализа ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. P-значения ≤ 0,05 считались статистически значимыми. Результаты статистического анализа были представлены в виде гистограммы.

Результаты

При гистологическом исследовании слизистая оболочка биоптатов десны в обеих группах была выстлана многослойным плоским эпителием относительно большой толщины с выраженным акантозом (рис. 1).

1.1)   1.2) 

Рис. 1. Гипертрофия и акантоз многослойного плоского эпителия десны:
1.1) биоптат ССТ. Светлопольная микроскопия. Увеличение ×50;
1.2) биоптат КМ. Светлопольная микроскопия. Увеличение ×50. Окраска гематоксилином-эозином

Fig. 1. Hypertrophy and acanthosis of the multilayered squamous epithelium of the gum:
1.1) biopsy of CTG. Light-field microscopy. Magnification ×50;
1.2) biopsy of CM. Light-field microscopy. Magnification ×50. Staining with hematoxylin-eosin

Собственно слизистая оболочка десны, отграниченная от эпителия базальной мембраной, представлена рыхлой соединительной тканью, непосредственно под эпителием – сосочковый слой и в глубоких отделах – сетчатый слой. Сосочковый слой имеет более рыхлую структуру, чем сетчатый слой. В сосочках, находящихся между эпителиальными гребнями, коллагеновые волокна собраны в пучки и расположены вертикально, что отчетливо видно при фазово-контрастной микроскопии (рис. 2).

1.1)   1.2) 

Рис. 2. Сосочковый слой слизистой оболочки десны:
1.1) биоптат ССТ. Фазово-контрастная микроскопия. Увеличение ×200;
1.2) биоптат КМ. Фазово-контрастная микроскопия. Увеличение ×200. Окраска гематоксилином-эозином

Fig. 2. Papillary layer of the gingival mucosa:
1.1) biopsy of CTG. Phase contrast microscopy. Magnification ×200;
1.2) biopsy of CM. Phase contrast microscopy. Magnification ×200. Staining with hematoxylin-eosin

Сетчатый слой представлен рубцовой тканью, состоящей из переплетающихся между собой или ориентированных продольно коллагеновых пучков, между которыми располагаются в основном фибробласты с незначительным количеством лейкоцитов и макрофагов. При окраске пикросириусом красным коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет (рис. 3.1, 3.2), а при поляризационной микроскопии с такой окраской волокна дают яркую анизотропию (рис. 3.3, 3.4). При окраске орсеином в этой ткани практически отсутствуют эластические волокна, что характерно для рубцов, единичные эластические волокна обнаруживаются лишь в околососудистых зонах (рис. 3.5, 3.6).

3.1)   3.2) 

3.3)   3.4) 

3.5)   3.6) 

Рис. 3. Формирование рубцовой ткани в сетчатом слое слизистой оболочки:
3.1) биоптат ССТ. Светлопольная микроскопия. Окраска пикросириусом красным. Увеличение ×50;
3.2) биоптат КМ. Светлопольная микроскопия. Окраска пикросириусом красным. Увеличение ×50;
3.3) биоптат ССТ. Поляризационная микроскопия. Окраска пикросириусом красным. Увеличение ×50;
3.4) биоптат КМ. Поляризационная микроскопия. Окраска пикросириусом красным. Увеличение ×50;
3.5) биоптат ССТ. Светлопольная микроскопия. Окраска орсеином. Увеличение ×200;
3.6) биоптат КМ. Светлопольная микроскопия. Окраска орсеином. Увеличение ×200

Fig. 3. The formation of scar tissue in the mesh layer of the mucous membrane:
3.1) biopsy of CTG. Light-field microscopy. Coloring by picrosirius red. Magnification ×50;
3.2) biopsy of CM. Light-field microscopy. Coloring by picrosirius red. Magnification ×50;
3.3) biopsy of CTG. Polarization microscopy. Coloring by picrosirius red. Magnification ×50;
3.4) biopsy of CM. Polarization microscopy. Coloring by picrosirius red. Magnification ×50;
3.5) biopsy of CTG. Light-field microscopy. Coloring with orsein. Magnification ×200;
3.6) biopsy of CM. Light-field microscopy. Coloring with orsein. Magnification ×200

В группе КМ по сравнению с ССТ отмечается более обширная зона рубцовой ткани и чаще встречаются очаги разрыхления и деструкции коллагеновых волокон (рис. 4).

4.1)   4.2) 

Рис. 4. Очаги разрыхления и деструкции коллагеновых волокон в сетчатом слое слизистой оболочки КМ:
4.1) Светлопольная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200;
4.2) Фазово-контрастная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200. Окраска гематоксилином-эозином

Fig. 4. Foci of loosening and destruction of collagen fibers in the mesh layer of the CM mucosa:
4.1) Light-field microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200;
4.2) Phase contrast microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200. Staining with hematoxylin-eosin

В группе ССТ глубже рубцового слоя видна ткань аутотрансплантата, в которой выявляются достаточно крупные участки резко выраженного склероза, а также сосуды с частично или полностью облитерированным просветом (рис. 5), в некоторых участках определяется прорастание новых сосудов.

5.1)   5.2)   5.3) 

Рис. 5. Дистрофические изменения ткани ССТ после трансплантации:
5.1) Светлопольная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200;
5.2) Фазово-контрастная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200. Окраска гематоксилином-эозином;
5.3) Светлопольная микроскопия. Окраска орсеином. Увеличение ×200

Fig. 5. Dystrophic changes in CTG tissue after transplantation:
5.1) Light-field microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200;
5.2) Phase contrast microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200. Staining with hematoxylin-eosin;
5.3) Light-field microscopy. Coloring with orsein. Magnification ×200

Под рубцовой тканью в группе КМ находится относительно рыхлая волокнистая соединительная ткань ксенотрансплантата, состоящая из двух компонентов: толстых и редких пучков коллагеновых волокон, с расположенной между ними сетью тонких коллагеновых волокон (рис. 6). Наблюдается постепенная резорбция КМ и его замещение собственной соединительной тканью.

При более детальном исследовании были отмечены различия в воспалительной инфильтрации. Так, в группе КМ в сосочковом и сетчатом слоях отмечается умеренная лимфо-макрофагальная инфильтрация, которая в основном прослеживается в участках с деструкцией коллагеновых волокон, а также васкулит и гиперемия сосудов.

В то же время в группе ССТ лимфо-макрофагальная инфильтрация эпителия минимальна. Во всей соединительнотканной основе встречаются незначительные лимфо-макрофагальные инфильтраты и сосуды со слабыми явлениями периваскулита.

6.1)  6.2)  6.3) 

Рис. 6. Дистрофические изменения ткани ССТ после трансплантации.
6.1) Светлопольная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200.
6.2) Фазово-контрастная микроскопия. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение ×200. Окраска гематоксилином-эозином.
6.3) Светлопольная микроскопия. Окраска орсеином. Увеличение ×200

Fig. 6. Dystrophic changes in CTG tissue after transplantation.
6.1) Light-field microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200.
6.2) Phase contrast microscopy. Staining with hematoxylin-eosin. Magnification ×200. Staining with hematoxylin-eosin.
6.3) Light-field microscopy. Coloring with orsein. Magnification ×200

По результатам морфометрического анализа было выявлено, что общая толщина слизистой оболочки сходным образом увеличивается в обеих группах. Среднее значение количества клеток воспаления в эпителиальном слое в группе ССТ было равно 7,1 ± 0,8, при этом в группе КМ – 12,8 ± 1,1 (p = 0,0001), в собственно слизистой оболочке этот показатель в группе ССТ был равен 63,8 ± 4,9, в группе КМ – 82,7 ± 9,0 (p = 0,03). Доля коллагеновых волокон в группе ССТ достигала 88,5 ± 0,9 %, а в группе КМ – 82,5 ± 1,8 % (0,005). По остальным показателям, которые отражены в гистограмме, статистически значимых различий не выявлено (рис. 7).

Рис. 7. Средние значения показателей в группах ССТ и КМ: толщина слоев; количество эпителиальных гребней и сосочков слизистой оболочки; длина эпителиальных гребней и сосочков собственно слизистой оболочки; количество клеток воспаления; площадь сосудов; доля коллагеновых и эластических волокон

Fig. 7. Average values of indicators in the CST and CM groups: thickness of layers; number of epithelial ridges and papillae of the mucous membrane; length of epithelial ridges and papillae of the lamina propria; number of inflammatory cells; vascular area; proportion of collagen and elastic fibers

Обсуждение результатов

В литературе описаны различные техники аугментации мягких тканей как в области зубов, так и в области дентальных имплантатов. Золотым стандартом по-прежнему считается использование субэпителиального соединительнотканного трансплантата [Thoma et al., 2018; Sanz-Martín et al., 2019; Ashurko et al., 2022a]. В настоящее время наряду с ССТ широко используются его заменители – ксеногенные коллагеновые матриксы [Suárez-López Del Amo et al., 2019; Baldi et al., 2020; Ashurko et al., 2022a]. Применение КМ изучалось в различных клинических ситуациях, в частности при имплантации в эстетически значимых зонах, а также при устранении одиночных или множественных рецессий [Tonetti et al., 2018; Sanz-Martín et al., 2019]. Механизмом действия КМ является стабилизация кровяного сгустка, образование каркаса для дальнейшей адгезии клеток, которые в дальнейшем образуют новую соединительную ткань [Caballé-Serrano et al., 2020; Toledano et al., 2020a].

Существует ограниченное число исследований, в которых проводилась гистологическая и морфометрическая оценка тканей, полученных в результате аугментации тем или иным способом. В нашем исследовании мы использовали коллагеновый матрикс Fibro-Gide (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland) – объемностабильный рассасывающийся матрикс свиного происхождения с поперечно-сшитой структурой. Коллагеновый матрикс Fibro-Gide был протестирован на экспериментальных моделях, демонстрируя хороший уровень биосовместимости, проникновения фибробластов и сосудистых элементов и без значительной воспалительной реакции [Thoma et al., 2014; Zeltner et al., 2017; Angelis De et al., 2021].

По результатам нашего исследования в обеих группах слизистая оболочка биоптатов была выстлана многослойным плоским эпителием с выраженным акантозом. Собственно слизистая оболочка была отграничена от эпителия базальной мембраной. Под ней располагается сосочковый, а затем сетчатый слой с более плотными и компактно расположенными коллагеновыми волокнами. Не было выявлено статистически значимой разницы по толщине слоев. Все эти данные сопоставимы с раннее полученными результатами гистологического анализа Ашурко и соавт. [Ashurko et al., 2022a; Ashurko et al., 2022b], а также данными зарубежных авторов [Schmitt et al., 2019; Angelis De et al., 2021], хотя данные авторы проводили исследование с использованием классического двухслойного матрикса. Thoma и соавт. проводили исследование с использованием ССТ и КМ с поперечно-сшитой структурой. В группе ССТ они не наблюдали различий между трасплантированной тканью и покрывным лоскутом, васкуляризация наблюдалась во всех образцах с относительно большим количеством мелких кровеносных сосудов [Thoma et al., 2016]. По нашим данным, в группе ССТ глубже рубцового слоя видна ткань с явлениями дистрофии, склероза и наличием сосудов с облитерированным просветом. По-видимому, эта ткань является тканью пересаженного аутотрансплантата, в которой собственные сосуды трансплантата подвергаются облитерации просвета, однако прорастают новые сосуды, благодаря чему некроза не происходит, а есть только небольшие участки дистрофии. Всё это свидетельствует о приживлении аутотрансплантата.

Ранее Lima и соавт. сообщали, что при культивировании фибробластов десны человека на коллагеновом матриксе in vitro они продемонстрировали высокую степень пролиферации и жизнеспособности [Lima et al., 2015]. В нашей работе мы также обнаружили очаги пролиферации фибробластов в сосочковом слое соединительнотканной основы. В работе Hélio и соавт. при исследовании соединительнотканного трансплантата и коллагенового матрикса через 3 месяца после аугментации не было выявлено статистически значимой разницы в количестве фибробластов на единицу площади, также не было отмечено признаков воспаления, а коллагеновый матрикс продемонстрировал полную резорбцию и замену его здоровой соединительной тканью [Hélio et al., 2019]. Song и соавт. проводили исследование на собаках in vivo, в котором сообщается, что коллагеновый матрикс бычьего происхождения способствовал увеличению толщины мягких тканей и показал полное замещение материала через 3 месяца после операции. Также по результатам этого гистологического анализа было отмечено наличие более длинных эпителиальных гребней, что соответствует нашим результатам [Song et al., 2019]. Данные показатели полностью сопоставимы с работой Artzi и соавт., где пациентам проводили увеличение толщины мягких тканей при помощи коллагенового матрикса Fibro-Gide (Geistlich Pharma AG, Wolhusen, Switzerland) [Artzi et al., 2022]. По срокам замещения ксенотрансплантата и наличию признаков воспаления наше исследование не согласуется с вышеописанными результатами. Так, по данным гистологического анализа, в группе КМ все еще протекает резорбция трансплантата и постепенно происходит замещение собственной соединительной тканью через 3 месяца наблюдения. Наблюдается условное увеличение толщины соединительнотканной основы за счет коллагенового матрикса. Однако со временем КМ может полностью резорбироваться и уплотниться из-за формирующегося рубца и, соответственно, тогда толщина мягких тканей десны уменьшится. Стоит отметить, что в отдельных образцах наблюдались крупные очаги воспалительной инфильтрации. При этом в группе КМ по сравнению с ССТ выше воспалительная инфильтрация в эпителиальном слое на 44,5 % и в собственно слизистой оболочке на 22,9 %.

Заключение

Результаты гистоморфометрического исследования тканей, полученных в результате использования коллагенового матрикса с поперечно-сшитой структурой, свидетельствуют о возможности его применения для формирования мягких тканей в области дентальных имплантатов. При этом коллагеновый матрикс не уступает аутотрансплантам в вопросе увеличения толщины мягких тканей, однако требуется проведение дополнительных исследований для получения более отдаленных результатов его использования.